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HYDS0034-100T 四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)
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HYDS0034-100T 四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)

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產品名稱:HYDS0034-100T 四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)

產品型號:HYDS0034-100T

產品廠商:上海古朵生物科技有限公司

簡單介紹

產品名稱:四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)?,免疫熒光(immunofluorescence,IF),通常是指用熒光標記的抗體示蹤或檢查樣品中相應抗原的方法。根據抗原抗體反應,將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標記在抗體上,與其相應的抗原反應后,在熒光顯微鏡下針對熒光標記分子的激發光發射光進行觀察,從而檢測目的指標的相

HYDS0034-100T 四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)的詳細介紹

免疫熒光(immunofluorescence,IF),通常是指用熒光標記的抗體示蹤或檢查樣品中相應抗原的方法。根據抗原抗體反應,將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標記在抗體上,與其相應的抗原反應后,在熒光顯微鏡下針對熒光標記分子的激發光發射光進行觀察,從而檢測目的指標的相對含量、在組織細胞中的定位。

產品名稱:四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)

原理介紹:酪酰胺信號放大(TSA,Tyramidesignalamplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法,類似常規免疫組化的DAB顯色方法,TSA 技術同樣采用HRP標記的二抗,同樣有對應的“顯色”步驟(HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物,產生活化熒光底物,活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結合,使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物,重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育,換另一種酪胺熒光素底物,如此往復就可實現多重標記。
TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結合位點),產生大量的酶促產物,該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結合,這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積,結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說,用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯熒光素),來催化后續添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯,使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理,前一輪非共價結合的抗體被洗掉,共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育,周而復始。等到所有抗體孵育結束,熒光素都結合好后,最后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育,因此無需擔心抗體交叉反應,以及一抗二抗種屬匹配問題,大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說,如果用TSA技術,同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗,而且信號放大的倍數大大增強。本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種:480,520,570,620,690,780,488,CY3.此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用??梢詫崿F單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能,極大豐富了此試劑盒的內涵。

產品名稱:四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)
試劑盒組成:488熒光染料(綠光)(即用型,5mL),-20℃;CY3熒光染料(紅光)(即用型,5mL),-20℃;TSA+增強劑,100ul,-20℃(可選);
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(5mL)4℃。
備注:488熒光染料、CY3熒光染料在-20度下,均為固體,使用之前需解凍。


TSA+增強劑使用方法:TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍,TSA+增強劑:熒光放大液=1:500,使用TSA+增強劑不是必須的選項,可以根據具體的情況選擇添加
或者不選擇添加。
操作流程:
1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ。取出放在通風廚內,酒精晾干后放入自來水中稍洗,蒸餾水洗。
2、抗原修復:組織切片置于盛滿PH9.0EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復(也可以用高壓1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他熱修復方法)。中火8min,?;?min,轉中低火7min,此過程中應防止緩沖液過度蒸發,切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復液和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定)。
3、阻斷內源性過氧化物酶:切片放入3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
4、BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。
5、加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X,切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發)
6、加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min,PBS洗三次。
7、熒光染料反應:488熒光染料(或者CY3熒光染料)反應10-15min,PBS洗三次。
8、重復2-7步驟(換用另外一種熒光染料)
9、DAPI復染細胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
10、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
11、鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖像。


染料 激發波長 發射波長
DAPI藍色 350 420
480 450 480
488綠色 480-490 512-520
CY3紅色 530-550 570-590
520綠色 490 520
570紅色 550 570
620 590 620
690 630 690
780 750 780

產品名稱:四色多重免疫熒光試劑盒(三標四色)

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