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HYDS0067-50T-100T 七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)
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HYDS0067-50T-100T 七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)

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產品名稱:HYDS0067-50T-100T 七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)

產品型號:HYDS0067-50T-100T

產品廠商:上海古朵生物科技有限公司

簡單介紹

產品名稱:七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色),免疫熒光(immunofluorescence,IF),通常是指用熒光標記的抗體示蹤或檢查樣品中相應抗原的方法。根據抗原抗體反應,將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標記在抗體上,與其相應的抗原反應后,在熒光顯微鏡下針對熒光標記分子的激發光發射光進行觀察,從而檢測目的指標的相對含

HYDS0067-50T-100T 七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)的詳細介紹

免疫熒光(immunofluorescence,IF),通常是指用熒光標記的抗體示蹤或檢查樣品中相應抗原的方法。根據抗原抗體反應,將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標記在抗體上,與其相應的抗原反應后,在熒光顯微鏡下針對熒光標記分子的激發光發射光進行觀察,從而檢測目的指標的相對含量、在組織細胞中的定位。

產品名稱:七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)
原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA, Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶          ( HRP) 對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法, 類似常規免疫組化的 DAB 顯色方法 , TSA 技術同樣采 用 HRP 標記的二抗, 同樣有對應的 “顯色”步驟 (HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物, 產生  活化熒光底物, 活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結合, 使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光    素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP 復合物, 重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育, 換另一種酪胺熒光素底物, 如此往復就可實現多重標記。
TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結
合位點), 產生大量的酶促產物, 該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、  組氨酸和酪氨酸殘基)結    合, 這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積, 結果使其檢測信號得到 10-100 倍增強。  簡單  來說, 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯熒光素) , 來催化后續 添加入體系的非活性熒光素。  熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化, 跟臨近蛋白的酪氨酸殘基    共價偶聯, 使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。  然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理,前一輪非共價 結合的抗體被洗掉, 共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。  再換個一抗來第二輪孵育 , 周而復始。  等到所有抗體孵育結束, 熒光素都結合好后, 最后去檢測結果。  由于每次體系中都只有單 一抗體孵育, 因此無需擔心抗體交叉反應, 以及一抗二抗種屬匹配問題, 大大減少了實驗設計時不同 種屬抗體選擇匹配的限制。  也就是說, 如果用 TSA 技術, 同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。  搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進行實驗, 而且信號放大的倍數大大增強。    本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種:  480, 520, 570 ,   620, 690, 780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。  可以實現單標、  雙標、    三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能, 極大豐富了此試劑盒的內涵。
產品名稱:七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)
試劑盒組成: 480 熒光染料 (即用型, 5mL),-20℃;  520 熒光染料(綠光)(即用型, 5mL),- 20℃;  570 熒光染料 (紅光)  (即用型, 5mL), -20℃;  620 熒光染料 (即用型, 5mL), -  20℃;  690 熒光染料 (即用型, 5mL), -20℃;   780 熒光染料 (即用型, 5mL), -20℃;   TSA+增強劑, 100ul,  -20℃ (可選) ;
高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (20mL) 4℃。
備注: 480 熒光染料 、520 熒光染料 、570 熒光染料、  620 熒 光染料、  690 熒光染料、  780 熒光染料 在-20 度下, 均為固體, 使用之前需解凍。
TSA+增強劑使用方法:  TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號 5-10 倍, TSA+增 強劑:  熒光放大液=1:500, 使用 TSA+增強劑不是必須的選項, 可以根據具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。
產品名稱:七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)
操作流程:
1、 石蠟切片脫蠟至水:  依次將切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風廚內,酒精晾干后放入自來水中稍洗, 蒸餾水洗。
2、 抗原修復:  組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復 盒中于微波爐內進行抗原修復 (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復方法)  。 中火 8min, ?;?nbsp;8min, 轉中低火 7min, 此過程中應防止緩沖液過度蒸發, 切勿 干片。  自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次, 每次 5min。 (修復液 和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定)  。
3 、 阻斷內源性過氧化物酶:  切片放入 3%過氧化氫溶液, 室溫避光孵育 15 min, 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次, 每次 5min。
4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) , 在圈內滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織, 室溫封閉 30min。
5、 加一抗:  輕輕甩掉封閉液, 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X,切片平放于避光濕盒 內 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內加少量水防止抗體蒸發)
6、 加 hrp 二抗:  玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次,每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織, 避光室溫孵育 50min, PBS 洗三次。
7、 熒光染料反應:  XXX 熒光染料反應 10-15min, PBS 洗三次。
8、 重復 2-7 步驟 (換用另外一種 XXX 熒光染料)
9、 DAPI 復染細胞核:  玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次, 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內滴加 DAPI 染液, 避光室溫孵育 10min。
10、    封片:  玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3 次, 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。
11、    鏡檢拍照:  切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖 像。
染料 激發波長 發射波長
DAPI 藍色 350 420
480 450 480
520 綠色 490 520

570 紅色 550 570
620 590 620
690 630 690
780 750 780

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